História Pravoslávneho kňazského seminára sa začala písať v roku 1948 pod názvom "Duchovný seminár" so sídlom v Karlových Varoch a hneď v nasledujúcom roku bol presťahovaný do Prahy. V roku 1950 bola zriadená Pravoslávna bohoslovecká fakulta so sídlom v Prešove na základe vládneho nariadenia č. 112 zo dňa 14. júna 1950 v zmysle zákona č.66/1950 Zb. Československej republiky o vysokých školách. Súčasťou fakulty bol aj bohoslovecký seminár.

V roku 1990 sa stala Pravoslávna bohoslovecká fakulta a jej kňazský seminár súčasťou Univerzity P. J. Šafárika v Košiciach. Od 1. januára 1997 boli fakulta aj kňazský seminár na základe zákona NR SR č.361/1996 Zb. o vysokých školách začlenené do Prešovskej univerzity v Prešove.

Od roku 1950 sídlili Pravoslávna bohoslovecká fakulta a Duchovný seminár v spoločnej budove na Sládkovičovej ulici v Prešove. V roku 1989 podľa nariadenia vlády a zákona musela fakulta odovzdať majetok pôvodnému majiteľovi. Z toho dôvodu jej boli pridelené nové priestory, ktoré musela Pravoslávna cirkev zrekonštruovať. Pravoslávna bohoslovecká fakulta bola presťahovaná na Masarykovu ulicu č. 15 a Pravoslávny kňazský seminár na Plzenskú ulicu č. 7 v Prešove. Pravoslávny kňazský seminár sa stal samostatným subjektom Prešovskej univerzity, no bol ekonomicky stále súčasťou administratívy fakulty.

Od 1. septembra 2003 sa Pravoslávny kňazský seminár stáva plnohodnotne samostatným pracoviskom Prešovskej univerzity v Prešove, ale samozrejme, vo výchovno-vzdelávacom procese je stále pokračovaním a pomocou pre PBF PU v Prešove.

V rokoch 1989-1991 boli riaditeľmi seminára duchovní Ján Zozuľak a Štefan Šak. V rokoch 1991-2011 bol riaditeľom (neskôr rektorom) Pravoslávneho kňazského seminára prot. Mgr. Emil Jarkovský. Od roku 2011 do roku 2021 bol rektorom seminára prot. prof. ThDr. Milan Gerka, CSc.

V súčasnosti je povereným riadiť Pravoslávny kňazský seminár protodiakon doc. ThDr. Ján Husár, PhD., vicerektor seminára.